1-Микробиология

Основные методы изучения морфологии бактерий. Бактериоскопический метод. Методы окраски микробов и их отдельных структур. Методы микроскопии (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная).

Микроскопический – патологический материал – мазок – микроскопия.
Морфологические свойства бактерий. Бактерии — микроорганизмы, не имеющие оформленного ядра (прокариоты).
Бактерии имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная.
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю — Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор — анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нельсону, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом микроскопе. Фазово-контрастная микроскопия основана на явлении интерференции света, прошедшего и не прошедшего через объект, и позволяет наблюдать прозрачные объекты, отличающиеся от окружающей среды (или других структур клетки) по показателю преломления или по толщине и вызывающие изменение фазы прошедшего через них света. Благодаря специальному приспособлению в объективе (фазовая пластинка) и в конденсоре (кольцевая диафрагма) эти объекты выглядят более темными (позитивный фазовый контраст) или более светлыми (негативный фазовый контраст) по сравнению с окружающей средой.
— Темнопольная микроскопия (ультрамикроскопия) основана на явлении светорассеивания. При темнопольной микроскопии в объектив попадают только лучи, рассеянные объектом, и не попадают прямые лучи от осветителя. Поэтому наблюдаемые микроорганизмы кажутся ярко светящимися на темном фоне. Темнопольную микроскопию применяют для прижизненного изучения лептоспир, спирохет, а также микроорганизмов слишком мелких, чтобы их можно было различить при обычном светлопольном освещении. Для темнопольной микроскопии используют обычные объективы и специальные темнопольные конденсоры.
— Люминесцентная микроскопия основана на использовании явления флюоресценции. Применяют специальные люминесцентные микроскопы или приспособления к обычным микроскопам. Так как большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, то их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разведенными растворами специальных красителей (флюорохромы), которые связываются с определенными структурами клетки.
— Электронная микроскопия. Изображение в электронном микроскопе образуется не с помощью световых лучей и стеклянных линз, а с помощью потока электронов, который фокусируется электрическим или магнитным полем. Разрешающая способность примерно в 2000 раз больше, чем светового (0,2 мкм), и с его помощью можно увидеть даже крупные молекулы. Применение электронного микроскопа значительно расширило знания о вирусах, фагах и других микроорганизмах.