Для лабораторной диагностики вирусных инфекций используются различные методы.
Вирусологическое исследование (световая микроскопия) позволяет обнаружить характерные вирусные включения, а электронная микроскопия – сами вирионы, и по особенностям их строения диагностировать соответствующую инфекцию (например, ротавирусную).
Для выделения вирусов используют заражение лабораторных животных, куриных эмбрионов или культуры тканей.
Первичную идентификацию выделенного вируса до уровня семейства можно провести с помощью:
• определения типа нуклеиновой кислоты (проба с бромдезоксиуридоном),
• особенностей ее строения (электронная микроскопия),
• размером вириона (фильтрование через мембранные фильтры с порами диаметром 50 и 100 нм),
• наличия суперкапсидной оболочки (проба с эфиром),
• гемагглютининов (реакция гемагглютинации),
• типа симметрии нуклеокапсида (электронная микроскопия).
Существенное значение для идентификации вирусов (до рода, вида, внутри вида) имеет также изучение их антигенного строения, которое проводится в реакции вирусонейтрализации с соответствующими иммунными сыворотками. Сущность этой реакции состоит в том, что после обработки гомологичными антителами вирус утрачивает свою биологическую активность (нейтрализуется) и клетка хозяина развивается так же, как и неинфицированная вирусом. Об этом судят по отсутствию цитопатического действия, цветной пробе, результатам реакции торможения гемагглютинации (РТГА), отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов, выживаемости чувствительных животных.
Методы иммунодиагностики (серодиагностики и иммуноиндикации). Они реализуются в самых разнообразных реакциях иммунитета:
• радиоизотопный иммунный анализ (РИА),
• иммуноферментный анализ (ИФА),
• реакция иммунофлюоресценции (РИФ),
• реакция связывания комплемента (РСК),
• реакция пассивной гемагглютинации (РПГА),
• реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и другие.
При использовании методов серодиагностики обязательным является исследование парных сывороток. При этом четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке в большинстве случаев служит показателем протекающей или свежеперенесенной инфекции. При исследовании одной сыворотки, взятой в острой стадии болезни, диагностическое значение имеет обнаружение антител класса Ig М, свидетельствующее об острой инфекции.
Молекулярно-генетических методов (ДНК-зондирование, полимеразной цепной реакции – ПЦР). В первую очередь с их помощью выявляют персистирующие вирусы, находящиеся в клиническом материале, с трудом обнаруживаемые или не обнаруживаемые другими методами.
Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.
Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей живот ных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.
Приготовление первичной культуры клеток складывает ся из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания получен ной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.
Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохра няются на протяжении нескольких десятков пассажей.
Их приготов ляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю щих способностью длительно размножаться in vitro в определен ных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки ам ниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоид ные клетки человека. Они представляют собой клеточную систе му, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток использу емой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают зло качественного перерождения и этим выгодно отличаются от опу холевых.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно вы сокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздей ствиям.
Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ря да вирусов используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим из менениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его обо лочках.
О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.
К недостаткам данного метода относятся невозможность об наружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очист ку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препа ратов.
Лабораторные животные. Видовая чувствительность живот ных к определенному вирусу и их возраст определяют репродук тивную способность вирусов. Во многих случаях только ново рожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в воз можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуциру ются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся кон таминация организма подопытных животных посторонними ви русами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данно го вируса, что удлиняет сроки исследования.